腺相关病毒(AAV)技术快速入门

腺相关病毒（AAV）作为一种安全、持久、高效、高特异性的基因操作工具，在生物学特别是神经生物学领域中被广泛使用。许多新手对于AAV的使用往往是知其然而不知其所以然。这篇短文将以图文结合的形式争取让大家在最短的时间内全面了解这种病毒工具。

什么是AAV？

野生型AAV是一种复制缺陷型微小病毒，需要腺病毒或疱疹病毒帮助其在体内复制扩增。而我们做实验用的是不需要辅助病毒的重组AAV病毒（rAAV）。将目的基因的CDS区序列或者RNAi干扰序列插入rAAV表达质粒中，包装病毒，然后直接使用rAAV感染细胞就能完成目的基因操作。

什么时候用rAAV？

当我们需要对特定基因进行过表达或干扰时，特别是做动物实验的时候，就可以使用rAAV病毒。针对不同的实验需求，下表可以帮助您选择合适的病毒工具。

病毒

表达系统

腺病毒表达系统

（Adenovirus）

慢病毒表达系统

（Lentivirus）

腺相关病毒

（Adeno-Associate）

病毒基因组

双链DNA病毒

RNA病毒

单链DNA病毒

复制

自主复制

自主复制

改造后可自主复制

是否整合

病毒基因组游离于宿主基因组外，瞬时表达外源基因

病毒基因组整合于宿主基因组，长时间、稳定表达外源基因

病毒基因组游离于宿主基因组外，通常感染神经组织，由于细胞不分裂所以可长时间表达

感染细胞

类型

感染分裂和不分裂细胞

感染分裂和不分裂细胞

感染分裂和不分裂细胞

表达丰度

高水平表达

中水平表达

中高水平表达

表达时间

快（1-2 天）

慢(  2-4天)

慢（1~2周以上）

滴度

滴度高达1012pfu/ml

滴度最高可达109 TU/ml

滴度高达1012~13v.g/ml

克隆容量

适合表达长度在3.5~4k以下的基因，滴度随插入片段长度增加而降低

适合表达长度在2.5~3k的基因，滴度随插入片段长度增加而降低

适合表达不超过2kb的外源片段，滴度随插入片段增加而降低

免疫原性

高免疫原性

低免疫原性

极低的免疫原性

rAAV的优点是什么？

1. 安全性高：目前还没有发现AAV对人体致病；每10个人中就有8个人在一生中会感染AAV，而rAAV更是去除了96%的AAV基因组，进一步确保了安全性。目前唯一通过欧盟药监局的基因治疗药物Glybera也是一种rAAV。

2. 免疫原性低：当AAV用局部大剂量感染肌肉、脑、眼等组织时，很少有感染上的细胞之后被免疫系统所清除。这种特性对于动物实验上显然极有帮助。

3. 感染谱广：几乎所有处于分裂期和静止期的细胞都可以使用AAV来感染。

4. 表达时间长：rAAV可在宿主细胞中形成附加体（episome）存在于细胞核中，在细胞分裂不旺盛的组织中可持续表达5个月以上。

5. 扩散性强：rAAV具有远高于腺病毒和慢病毒的扩散性，可以穿透血脑屏障，是最理想的神经元和胶质细胞感染工具。

6. 高稳定性：rAAV病毒可使用冰袋运输，并且对氯仿等试剂具有抗性。

7. 特异性强：rAAV有十数种常用的血清型，不同的血清型对不同的脏器有较高的识别及感染能力。

rAAV的局限性有哪些？

1. 体外实验表达水平较低：主要是因为rAAV病毒的基因组是单链DNA，在体外环境形成双链并转录翻译外源基因的效率非常低。可以在体外水平感染rAAV病毒的同时感染辅助病毒比如Ad5型腺病毒或者终浓度10~50mM的丁酸钠等方法提高细胞实验的rAAV表达量。

2. 需较长时间开始表达：同样是需要从单链DNA变成双链DNA，rAAV在感染后需要较长的时间来表达外源基因，所以rAAV感染后建议至少1周后做切片观察。

怎么选择合适的rAAV血清型？

目前文献中使用最多的rAAV血清型包括2,5,8,9。这几种血清型基本涵盖了所有组织和脏器的特异性感染，吉凯基因也可以提供这些常用血清型的rAAV改造和包装服务。下图是常用血清型所对应的组织脏器总结：

怎样实现器官/细胞特异的表达？

很多时候我们需要在特定的器官/细胞中表达外源序列而不影响其他脏器，这时我们有以下几种策略：

1. 局部注射，顾名思义就是直接在想表达的地方注射rAAV就可以了，适合器官水平特异感染，容易操作。

2. 使用组织/器官特异启动子来表达外源基因包装rAAV，此类rAAV即使感染了其他组织也由于特异性启动子而不会在其他组织中表达。

3. Cre-on，Flex，DIO，double floxed这些技术名称经常在文献中被提及，其实都是一回事，就是使用Cre-Loxp系统，经过两次染色体重组在特定脏器中表达外源基因。前提是我们需要获得特定的Cre小鼠后才可以使用这个技术。Cre-on系统的技术原理如下：

吉凯基因可以提供适合各种器官/细胞特异表达的rAAV工具满足实验需求。

体内使用rAAV的操作注意点有哪些？

1. 小鼠的操作通过尾静脉注射的rAAV量推荐在10E11~12v.g数量级，体积推荐在100~200ul；针对脑部的感染建议用量参考下表：

部位

注射器材

可注射体积

病毒量

脑室

大鼠

30-33GHamilton 针

不超过5ul

10E9v.g

小鼠

30-33GHamilton 针

不超过2ul

10E8v.g

核团

大鼠

直径为10-20um的玻璃微量注射器

不超过5ul

10E9v.g

小鼠

直径为10-20um的玻璃微量注射器

不超过2ul

10E8v.g

VTA

大鼠

直径为10-20um的玻璃微量注射器

不超过5ul

10E9v.g

小鼠

直径为10-20um的玻璃微量注射器

不超过2ul

10E8v.g

海马

大鼠

30-33GHamilton 针

不超过5ul

10E9v.g

小鼠

30-33GHamilton 针

不超过2ul

10E8v.g

2. 在实验过程中稀释病毒产品的等渗溶液没有其他特殊要求，常规的动物试验用等渗溶液即可，如PBS、生理盐水等。

体外使用rAAV的操作注意点有哪些？

1. 胰酶会破坏细胞表面的rAAV病毒受体，因此需要在胰酶消化12h后再进行rAAV感染操作。

2. 如感觉rAAV感染效果不佳，可尝试去除血清。

3. rAAV与细胞的吸附过程非常迅速，需要实现混匀后再处理细胞，不然会出现局部未被感染的情况。

4. rAAV感染不需要添加慢病毒助感染试剂诸如polybrene等。

用完后怎么处理？

对AAV最有效的消毒剂是新鲜配制的1%次氯酸钠溶液：

1. 配制时，将84消毒液原液加水稀释；

2. 浸泡15 min以达到消毒目的；

3. 可以用它处理可回收的物品如玻璃器皿或是污染废液（终浓度是1%），但如果是不锈钢器物切不可直接擦拭，否则会引起表面腐蚀。

其他的处理方式包括用2%戊二醛溶液或是0.25% SDS溶液，还可以121℃高温消毒1小时。

本文列举了一些常见的rAAV问题，如有在具体实验中遇到其他问题也欢迎联系当地吉凯基因业务员或拨打全国免费技术支持热线800-720-0302咨询。

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