培养基的制备与灭菌

一、实验目的

了解一般培养基的种类与用途，及制备培养基的基本原理，学习和掌握配制培养基的一般方法和步骤。

二、实验概述

培养基的制备

培养基是按照微生物生长发育的需要，用不同组分的营养物质调制而成的营养基质。人工制备培养基的目的，在于给微生物创造一个良好的营养条件。把一定的培养基放入一定的器皿中，就提供了人工繁殖微生物的环境和场所。自然界中，微生物种类繁多，由于微生物具有不同的营养类型，对营养物质的要求也各不相同，加之实验和研究上的目的不同，所以培养基在组成原料上也各有差异。但是，不同种类和不同组成的培养基中，均应含有满足微生物生长发育的水分、碳源、氮源、无机盐和生长素以及某些特需的微量元素等。此外，培养基还应具有适宜的酸碱度 (pH 值 ) 和一定缓冲能力及一定的氧化还原电位和合适的渗透压。

根据制备培养基对所选用的营养物质的来源，可将培养基分为天然培养基、半合成培养基和合成培养基三类。按照培养基的形态可将培养基分为液体培养基和固体培养基。根据培养基使用目的，可将培养基分为选择培养基、加富培养基及鉴别培养基等。

培养基的类型和种类是多种多样的，必须根据不同的微生物和不同的目的进行选择配制，本实验分别配制常用培养细菌、放线菌和真菌的牛肉膏蛋白胨培养基、高氏一号合成培养基和马铃薯蔗糖培养基等固体培养基。

固体培养基是在液体培养基中添加凝固剂制成的，常用的凝固剂有琼脂、明胶和硅酸钠，其中以琼脂最为常用，其主要成份为多糖类物质，性质较稳定，一般微生物不能分解，故用凝固剂而不致引起化学成份变化。琼脂在 95 ℃的热水中才开始融化，融化后的琼脂冷却到 45 ℃才重新凝固。因此用琼脂制成的固体培养基在一般微生物的培养温度范围内 (25 ℃ -37 ℃ ) 不会融化而保持固体状态。

消毒与灭菌的方法

灭菌是用物理或化学的方法来杀死或除去物品上或环境中的所有微生物。消毒是用物理或化学的方法杀死物体上绝大部分微生物 ( 主要是病原微生物和有害微生物 ) 。消毒实际上是部分灭菌。

在微生物实验、生产和科研工作中，需要进行纯培养，不能有任何杂菌，因此，对所用器材、培养基要进行严格灭菌，对工作场所进行消毒，以保证工作顺利进行。

消毒与灭菌的方法很多，一般可分为加热、过滤、照射和使用化学药品等方法。

1 、加热法

加热法又分干热灭菌和湿热灭菌两类。

1 ）干热灭菌

有火焰烧灼灭菌和热空气灭菌两种。火焰烧灼灭菌适用于接种环、接种针和金属用具如镊子等，无菌操作时的试管口和瓶口也在火焰上作短暂烧灼灭菌。通常所说的干热灭菌是在电烘箱内灭菌，此法适用于玻璃器皿如吸管和培养皿等的灭菌，在热空气 160 ℃ -170 ℃下保温 2 小时进行灭菌。

2 ）湿热灭菌

⑴高压蒸汽灭菌法 此法是将物品放在高压蒸汽灭菌锅内 1.05kg ／ cm 2 (15 磅 / 英寸 2 ) ， 121.3 ℃保持 15-30 分钟进行灭菌。时间的长短可根据灭菌物品种类和数量的不同而有所变化、以达到彻底灭菌为准。这种灭菌适用于培养基、工作服、橡皮物品等的灭菌。

⑵间歇灭菌法 有少数培养基例如明胶培养基、牛乳培养基、含糖培养基等用干热灭菌和高压蒸汽灭菌均会受到破坏，则必须用间歇灭菌法。此法是用阿诺氏流动蒸汽灭菌器进行灭菌。该器底层盛水，顶部插有温度计，加热后水蒸汽温度达到 100 ℃时，即循环流于器内，水蒸汽碰到器内物体时，又凝成水，流至底层贮水处，故不至干涸。灭菌时，将培养基放在器内，每天加热 100 ℃ 30 分钟、连续三天，第一天加热后，其中的营养体被杀死，将培养基取出放室温下 18-24 小时，使其中的芽孢发育成为营养体，第二日再加热 l00 ℃ 30 分钟，发育的营养体又被杀死，但可能仍留有芽孢，故再重复一次，使彻底灭菌。一般凡能用高压蒸汽灭菌的物品均不采用此法灭菌。

⑶煮沸消毒法 注射器和解剖器械等可用煮沸消毒法。一般微生物学实验室中煮沸消毒时间为 10-15 分钟，人用注射器和手术器械在有条件的地方，一般均采用高压蒸汽灭菌法或干热灭菌法灭菌。

2 、过滤灭菌

许多材料例如血清与糖溶液应用一般加热消毒灭菌方法，均会被热破坏，因此，采用过滤除菌的方法。应用最广泛的过滤器有蔡氏 (Seitz) 过滤器和膜过滤器。蔡氏过滤器是用银或铝等金属做成的，分为上、下两节、过滤时，用螺旋把石棉板紧紧地夹在上、下两节滤器之间，然后将溶液置于滤器中抽滤。每次过滤必须用一张新滤板。滤膜过滤器的结构与蔡氏过滤器相似，只是滤膜是一种多孔纤维素 ( 乙酸纤维素或硝酸纤维素 ) ，孔径一般为 0.45 m m ，过滤时，液体和小分子物质通过，细菌被截留在滤膜上，但若要将病毒除掉，则需更小孔径的滤膜。

3 、紫外线灭菌

紫外线波长在 200-300nm ，具有杀菌作用，其中以 265-266nm 杀菌力最强。无菌室或无菌接种箱空气可用紫外线灯照射灭菌。

4 、化学药品灭菌

化学药品消毒灭菌法是应用能杀死微生物的化学制剂进行消毒灭菌的方法。实验室桌面、用具以及洗手用的溶液均常用化学药品进行消毒灭菌。常用的有 2% 煤酚皂溶液 ( 来苏尔 ) 、 0.25% 新洁尔灭、 1% 升汞、 3-5% 的甲醛溶液、 75% 酒精溶液等，见表 1 。

表 1 常用化学杀菌剂应用范围和常用浓度表

1 、干热灭菌

用干燥热空气 (170 ℃ ) 杀死微生物的方法称干热灭菌。玻璃器皿 ( 如吸管、平板等 ) 、金属用具等凡不适于用其他方法灭菌而又能耐高温的物品都可用此法灭菌。培养基、橡胶制品、塑料制品等不能用干热灭菌法。

干热灭菌操作步骤：

⑴装箱 将准备灭菌的玻璃器具洗涤干净、晾干，用纸包裹好，放入灭菌的长铁盒 ( 或铝盒 ) 内，放入干热灭菌箱内，关好箱门。

⑵灭菌 接通电源，打开干热灭菌箱排气孔，等温度升至 80-100 ℃时关闭排气孔，继续升温至 160-l70 ℃计时，恒温 1-2h 。

⑶灭菌结束后，断开电源，自然降温至 60 ℃，打开电烘箱门，取出物品放置备用。

注意事项：

灭菌物品不能堆得太满、太紧，以免影响温度均匀上升。

灭菌物品不能直接放在电烘箱底板上，以防止包纸供焦。

灭菌温度恒定在 l60-l70 ℃为宜，温度过高，纸和棉花会被烤焦。

降温时待温度自然降至 60 ℃以下再打开箱门取出物品，以免因温度过高而骤然降温导致玻璃器皿炸裂。

2 、加压蒸汽灭菌法

高压蒸汽灭菌是将待灭菌的物品放在一个密闭的加压灭菌锅内，通过加热，使灭菌锅隔套间的水沸腾而产生蒸汽。待水蒸汽急剧地将锅内的冷空气从排气阀中驱尽，然后关闭排气阀，继续加热，此时由于蒸汽不能溢出，而增加了灭菌器内的压力，从而使沸点增高，得到高于 100 ℃的温度。导致菌体蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。

在同一温度下，湿热的杀菌效力比干热大，其原因有三：

①湿热中细菌菌体吸收水分，蛋白质较易凝固，因蛋白质含水量增加，所需凝固温度降低 ( 表 2) ；

②湿热的穿透力比干热大 ( 表 3) ；

③湿热的蒸汽有潜热存在，每 1 克水在 100 ℃时，由气态变为液态时可放出 2.26kJ 的热量。这种潜热，能迅速提高被灭菌物体的温度，从而增加灭菌效力。

表 2 蛋白质含水量与凝固所需温度的关系

在使用高压蒸汽灭菌锅灭菌时，灭菌锅内冷空气的排除是否完全极为重要，因为空气膨胀压大于水蒸汽的膨胀压，所以，当水蒸汽中含有空气时，在同一压力下，含空气蒸汽的温度低于饱和蒸汽的温度。灭菌锅内留有不同分量空气时，压力与温度的关系见表 4 。一般培养基用 1.05kg/cm2 ， 121.3 ℃ 15-30 分钟可达到彻底灭菌的目的。灭菌的温度及维持的时间随灭菌物品的性质和容量等具体情况而有所改变。例如含糖培养基用 0.56kg/cm 2 (8 磅 / 英寸 2) ， 112.6 ℃灭菌 15 分钟，但为了保证效果，可将其他成分先行 121.3 ℃， 20 分钟灭菌，然后以无菌操作手续加入灭菌的糖溶液。又如盛于试管内的培养基以 1.05kg/cm 2 ， 121.3 ℃灭菌 20 分钟即可，而盛于大瓶内的培养基最好以 1.05kg/cm2 灭菌 30 分钟。

表 4 灭菌锅内留有不同分量空气时，压力与温度的关系

蒸汽压力所用单位为 kg/cm 2 ( 千克 / 厘米 2 ) ，它与 1b/in2( 磅 / 英寸 2 ) 和温度的换算关系见表 5 。

手提式高压蒸汽灭菌锅的使用操作步骤：

首先将内层灭菌桶取出，再向外层锅内加入适量的水，使水面与三角搁架相平为宜。

放回灭菌桶，并装入待灭菌物品。注意不要装得太挤，以免防碍蒸汽流通而影响灭菌效果。三角烧瓶与试管口端均不要与桶壁接触，以免冷凝水淋湿包口的纸而透入棉塞。

加盖，并将盖上的排气软管插入内层灭菌桶的排气槽内。再以两两对称的方式同时旋紧相对的两个螺栓，使螺栓松紧一致，勿使漏气。

用电炉或煤气加热，并同时打开排气阀，使水沸腾以排除涡内的冷空气。待冷空气完全排尽后，关上排气阀，让锅内的温度随蒸汽压力增加而逐渐上升。当锅内压力升到所需压力时，控制热源，维持压力至所需时间。本实验用 1.05kg/cm2 ， 121.3 ℃， 20 分钟灭菌。

灭菌所需时间到后，切断电源或关闭煤气，让灭菌锅内温度自然下降，当压力表的压力降至 0 时，打开排气阀，旋松螺栓，打开盖子，取出灭菌物品。如果压力未降到 0 时，打开排气阀，就会因锅内压力突然下降，使容器内的培养基由于内外压力不平衡而冲出烧瓶口或试管口，造成棉塞沾染培养基而发生污染。

将取出的灭菌培养基放入 37 ℃温箱培养 24 小时，经检查若无杂菌生长，即可待用。

表 5 蒸汽压力与蒸汽温度换算关系

三、实验器材

1 、仪器：手提式或立式高压灭菌锅，隔水式电热恒温培养箱，电子天平，电热干燥箱。

2 、药品和试剂：蛋白胨 牛肉膏 葡萄糖 蔗糖 乳糖 明胶柠檬铁铵 尿素 硫代硫酸钠 （ NH4 ） 2 HPO 4 KH 2 PO 4 NaCl KNO 3 ０ . ４％ 溴甲酚紫 ０ . ０２％酚红 １％溴麝香草酚兰 １ N HCl 1N NaOH 。

3 、其他： 电炉 滤纸 纱布 漏斗 试管 发酵管 三角烧瓶 漏斗架 牛皮纸 棉绳 培养皿 移液管 白报纸 管筒 铝锅 玻棒 pH 试纸

四、操作步骤和内容

1 、培养基制备的一般步骤：

⑴称量：按照培养基的配方，计算所配培养基需要原料的准确数量，称取各种物质。

⑵配调：将称量好的各种物质根据要求先后放入定量的水中，在电炉上加热熔化，熔化时需不断搅拌（特别是固体培养基）待完全熔化后，补足所失水分。

⑶调 pH 值：一般用１ N NaOH 或 1N HCl 调节培养基的 pH 值到所要求的范围，测定 pH 值的方法一般 pH 试纸或比色管，需要时也可用 pH 计。

⑷加指示剂：对某些培养基，按要求加入一定量指示剂。

⑸过滤：用滤纸或２～４层的纱布过滤。固体培养基必须趁热用纱布过滤。

⑹分装：将过滤后的培养基分装于容器内，各容器的分装量如下：

A ．三角烧瓶：不超过容量的 1/2 ，高度的 1/3 。

B ．试管：液体培养基、高层培养基、半固体培养基约装试管容量的 1/4 ～ 1/3 ，斜面培养基约装 1/5 。

⑺加塞：培养基分装后，在试管口或烧瓶口塞上棉塞，如培养基在短期内使用，也可在试管口套上试管帽。塞的作用有二，一是阻止外界微生物进入培养基内，防止由此引起的污染。二是保证培养时有良好的通气性能，因此棉塞的好坏对实验的结果将有所影响。棉塞一般不宜用脱脂棉做，因为它易吸水变湿，造成污染，加塞时，棉塞总长的 2/3 在口内， 1/3 在口外。

图 10 － 3 棉塞制作过程

图 10 － 4 试管帽和棉塞

1 ．试管帽； 2 ．正确的棉塞； 3. 不正确的棉塞； 4. 不正确的棉塞

⑻包扎：加好塞后，将试管扎成捆，上面包一层牛皮纸，三角烧瓶加塞后则每瓶口上包上一层牛皮纸，然后用绳扎好，这样可以防止灭菌时冷凝水的沾湿和灭菌后灰尘侵入，贴上标签，标明培养基名称、组号。

⑼灭菌：最常用的是高压蒸汽灭菌法，培养基灭菌时的温度和灭菌时间，按照各种培养基的规定进行。以保证灭菌效果和不损坏培养基的必要成分；手提式高压蒸汽灭菌锅操作步骤如下：将包扎标记好的培养基放入高压锅（已加好水）中，将锅盖用螺旋旋紧（盖上的软管插入灭菌桶的槽中），不得漏气，开启放气阀，用电炉加热（内热式的则通电源加热），从冒蒸汽开始５分钟，关闭阀门，继续加热，待压力达到所需压力时，控制电源开关，保持恒温，并开始计算灭菌时间，达到规定的灭菌时间后，关掉电源，自然降温或慢慢开启放气阀，让压力表上的读数回到 ０ ，打开放气阀，拧松螺栓，拿掉盖子，取出灭过菌的培养基。若需制成斜面，则试管应倾斜放置，冷却后即成。做穿刺用的固体或半固体培养基，试管均应直立放置。

⑽鉴定：将消毒冷却后的培养基置于 37 ℃恒温箱内 24 小时后观察有无杂菌生长，若有杂菌生长则弃去不用，如无杂菌生长则接入微生物菌种，经培养后观察微生物生长发育情况，以便确定培养基是否合于实验要求。

⑾保存：经验定合格的培养基，一时用不完，应避免干燥、氧化、 pH 值的改变和杂菌的污染，可存放于冰箱（ 4 ℃左右）内或暗凉处清洁的柜内，这样保存数星期仍然可用。

图 10 － 5 斜面的放置 图 10 － 6 将培养基倒入培养皿内

2 、几种常用培养基的配制：（配方和灭菌要求见附录）

肉汤蛋白胨培养液 分装试管

营养琼脂培养基 分装三角烧瓶、试管（搁斜面）

糖发酵培养液 a 、葡萄糖 b 、乳糖 c 、蔗糖分装于装有发酵管的试管

葡萄糖蛋白胨培养基 分装试管

柠檬酸盐培养基 分装试管（搁斜面）

硝酸盐培养液 分装试管

明胶培养基 分装试管（直立柱）

柠檬酸铁铵培养基 分装试管（直立柱）

石蕊牛奶 分装试管

淀粉培养基 分装三角瓶

3 、常用玻璃器皿的包装和灭菌

⑴一般玻璃器皿的洗涤：所需灭菌的玻璃器皿一定是已经清洗干净。一般玻璃器皿可用去污粉、洗衣粉或肥皂水等擦洗，然后用自来水洗净。染菌或带菌的玻璃皿，先煮沸半小时后，再用自来水、洗衣粉等擦洗，冲净，经过洗涤后的玻璃器皿，以水在内壁均匀分布成一薄层而不出现水珠，为油垢除尽的标准，如做较准确的实验时，应先用洗液浸泡，再用自来水冲洗，烘干备用。吸过菌液的移液管和滴管，应先放在５％石炭酸水溶液或０ . ２％新洁尔灭水溶液中浸泡数小时灭菌，然后用自来水冲洗，如管内壁污垢过多，应先在酪酸洗液中浸泡数小时，再冲洗。

⑵常用玻璃器皿的包装：所待灭菌的物品外面必须先包好再灭菌。

①移液管和滴管的包装：在每管的上端塞上一段棉花，松紧要合适，长度约１～１ . ５厘米，其目的是既防止微生物吸入口中，也防止口中微生物吸入管中。包装的方法有两种，一种放入移液管筒内进行灭菌，这适合于较多的放在一起备用，另一种是单支用纸包装，用白报纸裁成宽４～５ cm ，长较管长１０ cm 的纸条，自移液管或滴管的尖端（注意尖端要用两层纸），以螺旋式包贴起来，最后多余的纸条打一个结，以防松脱。

②培养皿的包装：将清洁干燥的培养皿５～１０付用纸包成一包，不得露在纸外，或装入特制的培养皿筒内。

③试管和三角瓶的包装：试管塞上棉塞，三角瓶塞上棉塞或 通气塞 （用８层纱布做的塞子），外用牛皮纸包装。

⑶将包好的物品放入电热干燥箱内。

⑷灭菌：接好后，关闭烘箱，接通电源，打开加热开关，旋动恒温器旋钮，至指示红灯亮（即加热），升温至 160 ℃，开始恒温，２小时后切断电源，自然降温，在灭菌时，关闭排气孔打开鼓风开关。

图 10 － 7 单支移液管的包装

⑸待烘箱内温度下降到 60 ℃以下，就可取出物品。

干燥灭菌时应注意以下几点：

①温度不应超过 180 ℃；②严禁用油纸包装；③降到 60 ℃以下方可开烘箱门；④烘箱内物品不宜放得太多，以免阻碍空气流通。

五、思考题

1. 你所配制的培养基分属哪一类培养基，为什么？

2. 培养基配好后，是否应立即灭菌？为什么？

3. 高压蒸汽灭菌为何比干热灭菌所要求的温度低，时间短？